Биотехнологи из Германии отредактировали геном растения, привив его на модифицированный подвой. Ученые создали химерные растения, прививая два вида крестоцветных на генетически отредактированную резуховидку Таля. Подвой выступил в роли вектора для доставки CRISPR/Cas9 в привой и в семена.

Согласно эксперименту, несколько десятых долей процента от всех молекул мРНК Cas9, синтезированных в корне такого химерного растения, перемещаются в его побег. Предложенную технологию геномного редактирования можно применять для создания новых линий культурных растений. Статья опубликована в Nature Biotechnology.

Система геномного редактирования CRISPR/Cas занимает все больше места в медицинской и сельскохозяйственной промышленности (мы подробно рассказывали о ней в материале «Запомните эти буквы») — в первую очередь манипуляции касаются животных. Но подобные манипуляции с растениями несколько сложнее, чем с животными и бактериальными клетками. Ведь у растительных клеток есть полисахаридная клеточная стенка, а значит, невозможно доставить генетический материал в клетку с помощью электропорации (об этой ветви методик мы рассказывали в новости). И приходится либо действовать вирусными или бактериальными векторами, либо использовать другие методы геномного редактирования. А это сложно и порой требует много времени — особенно если у растения низкая скорость и эффективность полового размножения. К тому же, далеко не для всех культурных растений известны и легкодоступны соответствующие векторы.

Технология CRISPR/Cas работает быстрее, но для каждой новой генетической линии приходится создавать заново вектор.

Биотехнологи из Института молекулярной физиологии растений Общества Макса Планка под руководством Фридриха Краглера (Friedrich Kragler) предложили способ, как можно сделать вектор для доставки CRISPR/Cas в растение чуть более универсальным. За основу они взяли механизм межклеточного транспорта регуляторных РНК у высших растений.

Известно, что во флоэме находят высокую концентрацию внеклеточных РНК — как матричных, так и регуляторных. Такие РНК снабжены сигналами внеклеточной локализации — тРНК-подобными сигнальными последовательностями (TLS). Крупные молекулы нуклеиновых кислот могут передаваться между клетками через плазмодесмы (по симпласту) или по проводящей системе растений.

Именно этим механизмом и воспользовались ученые. По их задумке, можно создать одну трансгенную линию растений, в чьем геноме закодирована система редактирования генома с сигналом межклеточного транспорта. Если на такое растение привить другое, то РНК системы геномного редактирования дойдут по проводящей системе до растения-привоя и отредактируют ДНК в некоторых клетках. Среди этих клеток окажется и часть гамет. Тогда гибриды, полученные от такого подвоя, будут генетически отредактированными, и при этом в их геноме не будет самой системы CRISPR/Cas.

Ученые решили испытать технологию на популярном модельном объекте физиологии растений — резуховидке Таля (Arabidopsis thaliana). Они создали линию растения, снабженную направляющей РНК, «выключающей» ген нитратредуктазы (NIA1). Фермент нужен растению для усвоения азота — и если ген не функционирует, а растение растет на среде, бедной азотом, то это заметно по его внешнему виду, что упрощает эксперимент. Другая линия, которую создали авторы исследования, делала растения устойчивыми к гербициду глюфосинату.

Последовательности в генах, кодирующих систему CRISPR/Cas9, были фланкированы TLS-сигналами на основе метиониновой тРНК. Ученые выращивали ростки модифицированных растений до возраста 6-7 дней, после чего срезали их по нижнюю половину гипокотиля, и на них прививали недельные растения резуховидки «дикого типа». Спустя 14 дней после операции, в зависимости от использованных типов TLS, от половины до 90 процентов листьев растений приобрели «азотдефицитный» фенотип.

Секвенирование геномов побегов подтвердило, что в них появилась нефункциональная версия гена NIA1. ПЦР с обратной транскрипцией показала, что примерно каждая тысячная копия РНК Cas9 находится в привое — то есть в той части химерного растения, в геноме которой Cas9 не закодирована. Химерные растения зацвели и дали около 11,7 тысяч семян. Когда ученые секвенировали редактированный участок их генома, они обнаружили 61 случай геномного редактирования. Согласно расчетам, примерно каждый тысячный гибрид первого поколения lдолжен быть гомозиготным.

Но резуховидка не имеет хозяйственного значения, и ученые решили переключиться на родственную ей репу (Brassica rapa). Когда они прививали недельные ростки репы на двухнедельные ростки резуховидки, то в привое оказывалась уже примерно каждая 250-я РНК Cas9 (впрочем, неясно, с чем связан такой рост эффективности генетического редактирования в сравнении с первым экспериментом — с возрастом подвоя или с разной чувствительностью привоев разных видов).

По заключению профессора Краглера с коллегами, можно, прививая хозяйственные растения на уже созданные трансгенные модели, создавать относительно большой спектр новых ГМО, работая изначально с небольшим ассортиментом генетических линий. Для плодовитых культурных растений должно быть достаточно полученной частоты успешного геномного редактирования (каждое 250-е или 1000-е растение). Более того, как предположили ученые, могут существовать механизмы, повышающие чувствительность семян к геномному редактированию в сравнении с вегетативными органами растения — ведь CRISPR/Cas9 в семенах была даже активнее, чем в листьях и цветах.

Конечно, далеко не все травянистые растения легко поддаются прививке, но дальнейшая разработка методики может позволить упростить создание новых генетических линий культурных растений. Вся цепочка создания генетической линии, прививки и получения гибридов первого поколения заняла у авторов статьи около 6-7 месяцев. Но если подвой одной генетической линии использовать много раз для прививки нескольких видов растений, то срок создания новой генетической линии сокращается примерно в два раза — вопрос лишь в дизайне генетических конструктов и в эффективности прививки растений.

https://nplus1.ru/news/2023/01/09/crispr-grafting